Vari tipi di fluorocromi e anticorpi fluorescenti

I fluorocromi sono molecole fluorescenti che vanno a legarsi a specifiche strutture batteriche e ci permettono di osservare i batteri con la microscopia a fluorescenza. I fluorocromi sono sostanze che hanno un gruppo fluorescente che, dopo essere stato eccitato, emette nel visibile.

Nella microscopia a fluorescenza il preparato biologico viene esposto a luce ultravioletta di specifica lunghezza d’onda, selezionata dall’operatore. Il raggio colpisce il vetrino e i fluorocromi si eccitano. Tornando allo stato di riposo emettono un raggio di luce con un valore lunghezza d’onda compreso nel visibile.



Alcuni fluorocromi

  •  Arancio di acridina: dà nel rosso/arancio ed è un fluorocromo che si lega in particolare agli acidi nucleici, quindi permea attraverso le strutture batteriche e raggiunge gli acidi nucleici.
  • DAPI (diamino fenilindolo): emette nel blu e si lega agli acidi nucleici.
  • SYTO 9: emette nel verde. Lega acidi nucleici.
  • Propidio ioduro: emette nel rosso. Lega acidi nucleici.

Questi sono dei mutageni perché si vanno a legare al DNA, quindi devono essere trattati con cautela dall’operatore.

Live/Dead Stain

Una tecnica che utilizza fluorocromi è la “Live/Dead Stain” che ci consente di distinguere un batterio vivo da un batterio morto.

Vengono usati che utilizza 2 fluorocromi che sono il SYTO 9 e il propidio ioduro. La differenza fra i due, che ci consente di discriminare tra vivi e morti, è che il SYTO 9 è in grado di penetrare sia nei batteri vivi che nei morti, mentre il propidio ioduro penetra soltanto nelle cellule morte perché serve che ci sia una certa disgregazione delle strutture superficiali affinché possa permearvi.

Si utilizzano entrambi i fluorocromi insieme. Se andiamo nel verde osserveremo tutti i batteri, spostandoci sul canale del rosso osserviamo solo quelli morti. Sovrapponendo le immagini potremmo capire quali sono i batteri vivi e i batteri morti.

Nel microscopio a fluorescenza possiamo selezionare la lunghezza d’onda monocromatica della luce ultravioletta che colpisce il campione.



Gli anticorpi sono specifici per individuare uno specifico batterio

I fluorocromi sono molto aspecifici perché si legano agli acidi nucleici sia di cellule eucariote che di procariotiche. Se abbiamo la necessità di verificare la presenza di un preciso batterio in un campione biologico è impossibile farlo con i fluorocromi.

Ci sono delle tecniche di microscopia a fluorescenza che ci consentono di stabilire se nel campione è presente una determinata specie batterica. Questo si può fare grazie agli anticorpi.

Gli anticorpi sono delle molecole prodotte dalle cellule del sistema immunitario che servono a neutralizzare un determinato antigene, che solitamente è una particolare struttura esterna del batterio. Nel momento in cui vogliamo identificare uno specifico batterio utilizziamo un anticorpo specifico.

Per ogni antigene abbiamo specifici anticorpi che sono disponibili in commercio. Questi anticorpi si andranno a legare all’antigene con un legame altamente specifico, perché si legano solo ai batteri che lo possiedono. Agli anticorpi vengono legati i fluorocromi, in modo da poter visualizzare il batterio al microscopio a fluorescenza.

Gli anticorpi hanno una porzione costante e due porzioni variabili. Le porzioni variabili sono quelle che legano l’antigene, mentre a livello della porzione costante si va a legare il fluorocromo.

Agli anticorpi possiamo aggiungere dei fluorocromi

In commercio troviamo già gli anticorpi con i fluorocromi legati, noi dobbiamo deporre la soluzione contenente gli anticorpi sul preparato e poi effettuare un lavaggio per eliminare gli anticorpi che non si sono legati. A questo punto osserviamo al microscopio e potremmo verificare la presenza di determinate specie batteriche.

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Autore dell'articolo: Admin

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