Vari tipi di fluorocromi e anticorpi fluorescenti

Sono i fluorocromi le molecole fluorescenti che vanno a legarsi specificamente alle strutture batteriche e che ci permettono di osservare i batteri con la microscopia a fluorescenza. I fluorocromi sono sostanze che portano un gruppo fluorescente che, dopo essere stato eccitato, emette nel visibile in seguito a luce ultravioletta.



Vari tipi di fluorocromi

  •  Arancio di acridina: dà nel rosso/arancio ed è un fluorocromo che si lega in particolare agli acidi nucleici, quindi permea attraverso le strutture batteriche e raggiunge gli acidi nucleici.
  • DAPI diamino fenilindolo: emette nel blu e anch’esso è un fluorocromo che si lega agli acidi nucleici. Chiaramente questi sono dei mutageni perché si vanno a legare al DNA, quindi devono essere trattati con la dovuta cautela.
  • Poi ci sta quest’altra colorazione che è la Live/Dead Stain (significa colorazione vivi morti perché ci consente di distinguere un batterio vivo da un batterio morto) che utilizza 2 coloranti che sono il SYTO 9 (emette nel verde) e il Propidio ioduro (nel rosso).
    Anche questi si legano sempre al DNA e la differenza fra i due, che poi ci consente di discriminare tra vivi e morti, è che il SYTO 9 è in grado di penetrare (e raggiungere il DNA) sia nei batteri vivi che nei morti, mentre il Propidio ioduro soltanto nelle cellule batteriche morte perché ha bisogno che ci sia una certa disgregazione delle strutture superficiali affinché possa permearvi.
    Quindi, per questo tipo di colorazione, noi utilizziamo entrambi i coloranti insieme, dopo di che se andiamo nel verde osserveremo tutti i batteri sia vivi che morti, spostando la manopola sul canale del rosso andremo a visualizzare solo quelli colorati con il Propidio ioduro, quindi solo i morti. Sovrapponendo le immagini potremmo capire quali sono i batteri vivi e i batteri morti.

Nel microscopio a fluorescenza ci sta una manopola che consente di modificare (si ha la possibilità di selezionare) la lunghezza d’onda monocromatica della luce ultravioletta in uscita, che andrà a colpire il campione.



Gli anticorpi sono specifici per individuare uno specifico batterio

Questi fluorocromi sono molto aspecifici perché si legano agli acidi nucleici sia di cellule eucariote che di procariotiche. Se noi abbiamo la necessità di verificare in un campione la presenza di un preciso batterio è impossibile farlo con i fluorocromi.

Ci sono delle tecniche di microscopia a fluorescenza che ci consentono di stabilire se nel campione è presente una determinata specie batterica. Questo si può fare grazie agli anticorpi.

Gli anticorpi sono delle molecole prodotte dall’organismo umano che servono a neutralizzare un determinato antigene, che solitamente è una particolare struttura esterna del batterio. Nel momento in cui vogliamo identificare uno specifico batterio utilizziamo un anticorpo specifico.

Per ogni antigene possiamo produrre in vitro i corrispondenti anticorpi, disponibili in commercio. Questi anticorpi si andranno a legare all’antigene con un legame altamente specifico (si legano solo ai batteri che lo possiedono). Per poter utilizzare questo sistema antigene anticorpo nella microscopia a fluorescenza è necessario legare i fluorocromi (colorante) agli anticorpi, altrimenti non vedremo nulla.



Gli anticorpi hanno una porzione costante e due porzioni variabili. Le porzioni variabili sono quelle che legano l’antigene, mentre a livello della porzione costante si va a legare il fluorocromo.

Agli anticorpi possiamo aggiungere dei fluorocromi

In commercio troviamo già gli anticorpi con i fluorocromi legati, noi dobbiamo deporre la soluzione contenente gli anticorpi sul preparato e poi effettuare un lavaggio per allontanare gli anticorpi che non si sono legati. A questo punto osserviamo al microscopio e potremmo verificare la presenza di determinate specie batteriche.

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