Microscopio a fluorescenza

Il microscopio a fluorescenza è un microscopio a luce ultravioletta che utilizza una lunghezza d’onda specifica (scelta dall’operatore) per illuminare il campione.

Abbiamo detto che nei microscopi la lampada da utilizzare può essere a luce bianca, visibile oppure a luce ultravioletta e che in base alla luce che utilizziamo varia il potere di risoluzione (ne abbiamo parlato qui).



Cos’è la fluorescenza?

La fluorescenza è la capacità che hanno alcune molecole di passare ad uno stato eccitato quando sono irradiate da una luce di una certa lunghezza d’onda. Dopo di che riemettono una luce ad una lunghezza d’onda più elevata, che solitamente va nel visibile, esattamente nel momento in cui gli atomi passano dallo stato eccitato allo stato di riposo.

In questo tipo di microscopia irradiamo il campione con luce ultravioletta, il campione passa ad uno stato eccitato e quando gli elettroni ritornano allo stato di riposo lo stesso campione emette una luce che va nel visibile e che può essere percepita perché colorata (può essere luce rossa, verde o blu).

Ovviamente i batteri non si comportano in questo modo perché non sono fluorescenti. Dobbiamo quindi trattare i batteri con molecole fluorescenti che si andranno a legare alle loro strutture cellulari. Questi composti sono detti fluorocromi.

Osservare al microscopio a fluorescenza

Dopo aver marcato i batteri con sostanze fluorescenti li esponiamo al microscopio. Questo microscopio va a valutare la luce che il campione emette e non la luce che attraversa il campione (come avviene nel microscopio ottico).



Componenti del microscopio a fluorescenza

Ci sono delle parti fondamentali del microscopio su cui poniamo l’attenzione:

  • Lampada ad arco a vapori di mercurio: (non una lampadina normale) che è la lampada che genera luce ultravioletta.
  • Filtro di eccitazione: che serve a selezionare una determinata lunghezza d’onda ultravioletta (in base alla lunghezza d’onda che scegliamo il campione emetterà nel verde, nel blu o nel rosso).
  • Condensatore a campo oscuro: serve ad aumentare il contrasto delle strutture che vediamo legate dalle molecole fluorescenti, quindi si fa in modo che lo sfondo sia nero: i batteri saranno colorati di verde, di rosso o di blu e tutto il resto sarà nero, perché il condensatore in campo scuro non fa altro che allontanare (deviare) tutte le radiazioni che non provengono dal campione.
  • Filtro di sbarramento: serve semplicemente ad evitare che qualche possibile residuo (anche una minima quantità) di luce ultravioletta proveniente dalla lampada del microscopio raggiunga gli occhi dell’osservatore perché la luce ultravioletta è nociva per l’occhio umano.

Immagine del microscopio a fluorescenza

Struttura e componenti di un microscopio a fluorescenza

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