La colorazione di gram: passaggi e coloranti utilizzati

La colorazione di Gram è una colorazione composta che, attraverso l’utilizzo di due coloranti differenti, ci consente di distinguere batteri gram positivi e gram negativi. 

Questo tipo di colorazione sfrutta le differenze nell’organizzazione e nello spessore della parete batterica. La parete cellulare nei due tipi di batteri “reagisce” in modo differente alla colorazione e le cellule vengono colorate in maniera differente.

I passaggi da effettuare prima della colorazione di Gram

Prima della colorazione è importante che tutti i processi inizino a partire da una colonia isolata. Se prendiamo un mix di colonie non si capirebbe nulla, perché vedremo batteri di dimensioni, forma e colori diversi e non riusciremmo a distinguerli.

Se partiamo da una sospensione batterica liquida la prima cosa da fare è quindi ottenere una colonia isolata, ad esempio attraverso la tecnica delle diluizioni su piastra.

Dopo aver ottenuto una colonia isolata stemperiamo (distribuiamo uniformemente) la colonia su un vetrino in soluzione fisiologica. Facciamo asciugare la sospensione batterica in modo che aderisca bene e procediamo con la fissazione. A questo punto siamo pronti per effettuare la colorazione di Gram.

1° passaggio: colorazione con il cristal violetto

Come primo colorante utilizziamo il cristal violetto e lo distribuiamo sul preparato in maniera omogenea fino a coprirlo. Lo si lascia agire per 1 minuto, poi si lava l’eccesso di colorante con acqua distillata.

Il cristal violetto è in grado di permeare a livello degli strati più superficiali della cellula batterica. Questo avviene per tutti i batteri sia Gram positivi che negativi e tutte le cellule si colorano di viola, indipendentemente dalla tipologia di parete o strato superficiale.

2° passaggio: soluzione di Lugol

A questo punto il secondo passaggio della colorazione di Gram è il trattamento con un mordente o condensante, detto anche soluzione di Lugol, che è una soluzione contentente iodio e ioduro di potassio.

Questo trattamento si esegue sempre coprendo il preparato con delle gocce di mordente e lo si lascia agire per un minuto. Dopo di che si lava sempre con acqua distillata.

Il trattamento con il mordente serve a rafforzare il legame del colorante primario (cioè del Cristal violetto) alle strutture cellulari. Al microscopio tutti i batteri appariranno ancora viola.

3° passaggio: decolorazione con etanolo

Subito dopo l’aggiunta del mordente effettuiamo una decolorazione. Questo trattamento di decolorazione si esegue con etanolo (si utilizza alcol etilico assoluto) per 30 secondi. Questo trattamento ha la funzione di disidratare le strutture cellulari e, disidratandole, di formare una sorta di barriera impermeabile al colorante (cioè al Cristal violetto) che aveva inizialmente colorato le strutture.

Proviamo a capire quello che succede sapendo che nei batteri Gram positivi la parete è spessa e voluminosa. Nel momento in cui noi andiamo a sottrarre a questo rivestimento le molecole di acqua, questo si restringe e va a formare una vera e propria barriera che diventa impermeabile al cristal violetto. Per questo motivo i batteri Gram positivi non si decolorano e rimangono colorati di viola.

Nei batteri Gram negativi invece la parete batterica è molto più sottile. Quando viene disidratata, la barriera che si viene a creare rimane molto sottile e risulta ancora permeabile al Cristal violetto. Il colorante primario riesce a fuoriuscire e i batteri Gram negativi si decolorano.

4° passaggio: colorazione di contrasto con safranina

A questo punto subentra la necessità di effettuare una colorazione secondaria, utilizzando la safranina (colorante secondario) perché dobbiamo vedere se ci sono batteri Gram negativi. Se ci sono il colorante li colorerà e li potremmo visualizzare al microscopio ottico.

Come colorante secondario si utilizza la safranina che è colorata di rosa, un colore diverso rispetto al cristal violetto (il Cristal violetto è blu viola, la safranina è rosa). La safranina la si fa agire sempre per un minuto coprendo tutto il vetrino e poi lavando con acqua.

Visualizzazione al microscopio

Dopo aver preparato il vetrino lo facciamo asciugare e poi lo osserviamo al microscopio: i batteri Gram+ appariranno viola, i batteri Gram- appariranno rosa. Un altro tipo di colorazione composta è la colorazione per alcol-acido resistenza che ci contente di riconoscere la presenza di corinebatteri e micobatteri.

Leggi anche: parete Gram+ e parete Gram-

Schema riassuntivo della colorazione di Gram

Passaggi della colorazione di Gram

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