La colorazione di gram: passaggi e coloranti utilizzati

La colorazione di Gram è una colorazione composta che, attraverso l’utilizzo di due coloranti differenti, ci consente di distinguere batteri gram positivi e gram negativi.

Questo tipo di colorazione sfrutta le differenze nella organizzazione e nello spessore della parete batterica esistente tra Gram+e Gram-: la parete cellulare nei due tipi di batteri “reagisce” in modo differente alla colorazione e le cellule batteriche vengono colorate con due colori diversi (viola e rosa).



I passaggi da effettuare prima della colorazione di Gram

Prima della colorazione è importante che tutti i processi inizino a partire da una colonia isolata, infatti se prendiamo un mix di colonie non si capirebbe nulla, perché vedremo batteri di dimensioni diverse e non riusciremmo a distinguerli. Se partiamo da una sospensione batterica liquida la prima cosa da fare è quindi ottenere una colonia isolata, ad esempio attraverso delle diluizioni su piastra.

Dopo aver ottenuto una colonia isolata stemperiamo (distribuiamo uniformemente) la colonia su un vetrino in soluzione fisiologica. Poi facciamo asciugare la sospensione batterica in modo che aderisca bene al vetrino.

1° passaggio: colorazione con il cristal violetto

Come primo colorante utilizziamo il cristal violetto e lo distribuiamo sul preparato in maniera omogenea fino a coprirlo. Lo si lascia agire per 1 minuto, dopo di che si lava l’eccesso di colorante con acqua distillata.

Il Cristal violetto è in grado di permeare a livello degli strati più superficiali della cellula batterica. Questo avviene per tutti i batteri sia Gram positivi che negativi e tutte le cellule si colorano di viola, indipendentemente dalla tipologia di parete o strato superficiale.



2° passaggio: soluzione di Lugol

A questo punto il secondo passaggio della colorazione di Gram è il trattamento con un mordente o condensante, detto anche soluzione di Lugol, che è una soluzione contentente iodio e ioduro di potassio. Questo trattamento si esegue sempre coprendo il preparato con delle gocce di mordente e lo si lascia agire per un minuto. Dopo di che si lava sempre con acqua distillata.

Il trattamento con il mordente serve a rafforzare il legame del colorante primario (cioè del Cristal violetto) alle strutture cellulari. Al microscopio tutti i batteri appariranno ancora viola.

3° passaggio: decolorazione con etanolo

Subito dopo il mordente effettuiamo una decolorazione. Questo trattamento di decolorazione si esegue con etanolo (si utilizza alcol etilico assoluto) per 30 secondi. Questo trattamento con etanolo ha la funzione di disidratare le strutture cellulari e, disidratandole, di formare una sorta di barriera impermeabile al colorante (cioè al Cristal violetto) che aveva inizialmente colorato le strutture.

Non conoscendo ancora la parete batterica proviamo a capire quello che succede se immaginiamo che nei batteri Gram positivi ci sia una parete (rivestimento superficiale) molto spessa e voluminosa. Nel momento in cui noi andiamo a sottrarre a questo rivestimento le molecole di acqua, questo rivestimento si restringe e va a formare una vera e propria barriera che diventa impermeabile al cristal violetto. Per questo motivo i batteri Gram positivi non si decolorano e rimangono colorati di viola.



Nei batteri Gram negativi invece la parete batterica è molto più sottile (è praticamente un monostrato) quindi quando viene disidratata la barriera che si viene a creare rimane comunque molto sottile, per cui non viene ostacolata la fuoriuscita del cristal violetto come nei Gram postivi. Nei Gram negativi questa barriera risulta ancora permeabile al Cristal violetto quindi il colorante primario riesce comunque a fuoriuscire. I Gram negativi si decolorano.

4° passaggio: colorazione di contrasto con safranina

A questo punto subentra la necessità di effettuare una colorazione secondaria, utilizzando la safranina (colorante secondario) perché dobbiamo comunque vedere se ci sono batteri Gram negativi. Se ci sono Gram negativi a questo punto il colorante li colorerà e li potremmo visualizzare.

Come colorante secondario si utilizza la safranina che è colorata di rosa, un colore diverso rispetto al cristal violetto (il Cristal violetto è blu viola, safranina è rosa).

La safranina la si fa agire sempre per un minuto coprendo tutto il vetrino e poi lavando con acqua. Si chiama anche colorazione di contrasto perché effettivamente ci consente, se abbiamo sullo stesso preparato sia batteri Gram postivi che negativi, di distinguerli.



Visualizzazione al microscopio

Dopo aver preparato il vetrino lo facciamo asciugare e poi lo osserviamo al microscopio: i batteri Gram+ appariranno viola, i batteri Gram- appariranno rosa.

Un altro tipo di colorazione composta è la colorazione per alcol-acido resistenza che ci contente di riconoscere la presenza di corinebatteri e micobatteri.

Leggi anche: parete Gram+ e parete Gram-

Schema riassuntivo della colorazione di Gram

Passaggi della colorazione di Gram

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