Colorazione per alcol-acido resistenza o di Ziehl-Neelsen

Negli appunti precedenti abbiamo visto la colorazione composta di Gram, che ci consente di distinguere i batteri Gram+ dai batteri Gram-. In questi appunti invece vediamo un’altra colorazione composta: la colorazione di Ziehl-Neelsen.



Dove viene usata la colorazione di Ziehl-Neelsen?

Questa colorazione è molto utilizzata soprattutto in diagnostica clinica perché è una colorazione che si esegue per identificare batteri patogeni umani che sono in particolare i micobatteri (in particolare il Mycobacterium tuberculosis, agente eziologico della tubercolosi e simili) e i corinebatteri (come corynebacterium diphtheriae, agente eziologico della difterite).

Si chiama colorazione per alcol-acido resistenza perché micobatteri e corinebatteri sono batteri alcol-acidi resistenti.

Caratteristiche di micobatteri e corinebatteri

Questi micobatteri e corinebatteri hanno nella parete batterica delle molecole particolari che si chiamano acidi micolici, che sono degli acidi grassi ramificati a lunga catena. Essendoci queste molecole idrofobiche sarebbe impraticabile la colorazione di Gram, che come abbiamo visto utilizza coloranti ionici.

Leggi i nostri appunti sui coloranti

Colorando micobatteri e corinebatteri con la colorazione di Gram non riusciamo a vedere nulla, la safranina e il cristal violetto difficilmente riescono a permeare gli acidi micolici perché sono dei coloranti ionici, quindi interagiscono con strutture idrofiliche mentre gli acidi micolici sono molecole idrofobiche.

1° passaggio: colorazione con fucsina basica fenicata

Per i motivi sopra elencati il colorante che viene utilizzato in questa colorazione è la fucsina basica fenicata, in grado di attraversare lo strato di acidi micolici presente in questi batteri. La fucsina basica è trattata con acido fenico. Il trattamento con acido fenico, che si chiama fenicazione, aumenta il potere di penetrazione della fucsina basica.



Non solo, al trattamento con acido fenico dobbiamo aggiungere un altro trattamento: il trattamento a caldo. La colorazione dei micobatteri è una colorazione che avviene a caldo.

Mentre la colorazione di Gram si esegue a temperatura ambiente, la colorazione di Ziehl Neelsen è molto più efficace se viene eseguita esponendo il vetrino a una fonte di calore, perché questo probabilmente “aumenta la fluidità” dei lipidi e quindi facilita la penetrazione del colorante nelle strutture cellulari dei micobatteri. Facciamo agire il colorante primario per 3 o 5 minuti a caldo (anche il tempo è molto più lungo).

2° passaggio: decolorazione

Dopo di che si fa una decolorazione più spinta rispetto a quella che si fa con il metodo di Gram utilizzando acido solforico al 20%. In realtà si utilizza sia l’alcol (etanolo) che l’acido (acido solforico) come agenti decoloranti, ecco perché la colorazione si chiama colorazione per alcol acido resistenza.

Questa decolorazione forte avviene per 1 minuto anziché per 30 secondi: tutti i batteri si decoloreranno tranne i micobatteri o corinebatteri, perché sono alcol acido resistenti. Non si decolorano perché questo strato di acidi micolici intrappola ancora più fortemente il colorante.

In un espettorato (catarro) ci stanno più specie batteriche insieme (gram positivi, negativi, micobatteri) e non è mai sterile, quindi dovremmo essere in grado di distinguere i micobatteri da tutto il resto della flora microbica commensale eventualmente presente.



Nell’espettorato inoltre, non vi è una coltura pura. Oltre ai batteri commensali ci sono le cellule eucariotiche che ci portiamo appresso. Quindi i micobatteri non si decoloreranno, tutti gli altri sì (gram positivi e negativi)

Se non sono presenti micobatteri, tutti i batteri di decoloreranno (bisogna però vedere i batteri eventualmente presenti ed escludere quindi con cognizione di causa la presenza di micobatteri).

3° passaggio: colorazione di contrasto con blu di metilene

Effettuiamo allora anche in questo caso una colorazione di contrasto con il blu di metilene. Quindi il colorante secondario (blu di metilene) è sempre un colorante che ha un colore diverso rispetto al colorante primario (rosa).

Tutti i batteri diversi dai micobatteri e corinebatteri si coloreranno di blu mentre se sono presenti micobatteri e corinebatteri li vedremo colorati di rosa.

Tutti gli altri batteri si coloreranno di blu e questo è importante perché ci permette di far aumentare il contrasto e far risaltare questi batteri patogeni eventualmente presenti.



Schema riassuntivo

Passaggi della colorazione di Ziehl-Neelsen

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