Immunoenzimatica: test ELISA diretto e indiretto

Una variante all’immunofluorescenza è rappresentata dalle reazioni immuno-enzimatiche, che appartengono alla grande famiglia della diagnosi sierologica. Il vantaggio dell’immunoenzimatica è che possono essere utilizzati anche altri campioni biologici, come sangue e urina.



Come funziona?

In questo caso vengono utilizzati degli anticorpi marcati con attività enzimatiche per le quali abbiamo a disposizione un substrato che, nel momento in cui reagisce, libera il colore. Quindi non rileviamo una fluorescenza ma una chemio-luminescenza, la quale può essere osservata ad occhio nudo o utilizzando degli appositi strumenti.

  • Gli anticorpi sono coniugati con enzimi quali la perossidasi, la fosfatasi alcalina, la β-galattosidasi senza alterarne la capacità di combinazione con gli antigeni corrispondenti.
  • Il legame degli anticorpi coniugati con l’enzima all’antigene viene svelato aggiungendo il substrato ed i reattivi necessari ad evidenziare l’attività dell’enzima, il quale per essere impiegato in una reazione di questo tipo deve essere in grado di catalizzare una reazione caratterizzata da un prodotto terminale colorato.
  • Le reazioni enzimatiche possono essere impiegate per la ricerca di antigeni o anticorpi.
  • L’emissione chimiluminescente del prodotto di reazione enzimatica può essere captata ed analizzata da un luminografo, connesso ad un microscopio ottico, a sua volta interfacciato con un analizzatore computerizzato d’immagine che consente di evidenziare i segnali chemiluminescenti, guardandone l’intensità per mezzo di una scala di colori convenzionale.

Test ELISA diretto

E’ usato per la diagnosi diretta, quindi per rilevare componenti antigenici di patogeni, o metaboliti antigenici, da sangue, urine a altri campioni biologici.

Se nel campione è presente l’antigene viene legato dall’anticorpo e dobbiamo mettere in evidenza la formazione del complesso immune: proprio per questo gli anticorpi che usiamo sono marcati marcati con enzimi. Dopo il lavaggio aggiungiamo il substrato e se si sviluppa il colore la reazione sarà positiva.



Con il test ELISA diretto usiamo anticorpi marcati con enzimi



Test ELISA indiretto

E’ usato per la diagnosi indiretta, quindi per rilevare anticorpi contro un antigene noto in campioni di siero umano. Nel caso dell’ELISA indiretto sul supporto è depositato l’antigene.

Si aggiunge il siero, si tiene ad incubare e si effettua il lavaggio. Se nel siero sono presenti gli anticorpi si formerà il complesso immune, il quale sarà evidenziato usando degli anticorpi secondari marcati con gli enzimi, che si legano agli anticorpi primari legati a loro volta all’antigene adeso sul supporto.

Per mettere in evidenza la formazione del complesso immune aggiungiamo il substrato e se si sviluppa il colore, la reazione sarà positiva.

Con il test ELISA diretto usiamo anticorpi secondari marcati con enzimi

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Autore dell'articolo: Admin

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