Genotipizzazione

Abbiamo già parlato qui della tipizzazione dei batteri e del suo utilizzo e abbiamo visto che si divide in fenotipizzazione e genotipizzazione. In questi appunti parliamo della tipizzazione effettuata sulla base delle caratteristiche genetiche dei batteri.  Le tecniche sono numerose:

  • Profilo plasmidico;
  • RFLPs-PDGE;
  • Southern blot-ribotyping;
  • PCR-RFLP (ARDRA);
  • RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA);
  • Microarray;
  • MLST (Multilocus sequence typing).



Profilo plasmidico

Si estraggono dalle cellule batteriche e si fa una comparazione del numero e delle dimensioni dei plasmidi.

Per estrarre i plasmidi si utilizza prima il lisozima che rompe la parete cellulare, poi l’SDS insieme all’NaOH che denatura gli acidi nucleici. Poi neutralizza l’ambiente basico con l’acetato di potassio.

Con la neutralizzazione avviene la rinaturazione solo del DNA plasmidico. Si centrifuga e il sovranatante conterrà il DNA plasmidico. Poi si fa l’estrazione fenolica e infine la precipitazione con etanolo.

Isolati che appartengono allo stesso ceppo presenteranno frammenti delle stesse dimensioni ma questo non basta perché bisogna fare un’analisi di restrizione dei plasmidi.

RFLPsPDGE

Analisi dei polimorfismi dei frammenti di restrizione.

Questa analisi si fa con l’elettroforesi in campo pulsato. Si usano enzimi che tagliano poco e otteniamo pochi frammenti ma di grosse dimensioni. Anche qui confrontiamo il numero di frammenti e le dimensioni di frammenti con ceppi già conosciuti.

Southern blot-ribotyping

Si fa una ribo-tipizzazione che utilizza gli RNA ribosomali, che sono degli importanti marcatori filogenetici perché nei 16S ci sono delle regioni conservate tra batteri della stessa specie e degli stessi ceppi.

Il DNA viene digerito con enzimi che tagliano frequentemente e i frammenti vengono trasferiti su filtro: la sonda sarà il DNA che codifica per l’rRNA16S. Isolati che appartengono allo stesso ceppo avranno profili di ibridazione/restrizione simili.



PCR-RFLP (ARDRA)

Questa è una PCR in cui si amplificano i geni ribosomali (ANDRA sta per Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis).

I primer vengono disegnati sulla base delle regioni costanti e, ciò che varia, è la regione che viene amplificata. I frammenti che otteniamo (RNA 16S) vengono sottoposti a RFLP, cioè a restrizione. Poi si confrontano i profili di restrizione.

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Analisi dei frammenti di amplificazione che otteniamo utilizzando un solo primer. L’amplificazione terminerà in posizioni diverse in base al ceppo del batterio.

Microarray

Sono dei supporti solidi con moltissimi pozzetti. Sul fondo dei pozzetti sono adese delle sonde che corrispondono a DNA appartenente a ceppi diversi.

La rilevazione del segnale di ibridazione ci dirà a quale ceppo appartiene il nostro isolato. Di solito la rilevazione si fa con i fluorocromi.

MLST (Multilocus sequence typing)

Isolati che appartengono allo stesso ceppo presentano sequenze conservate in geni particolari che sono geni house-keeping. La prima cosa da fare è individuare una decina di geni house-keeping da considerare (regioni che vanno da 400 a 500 paia di basi), quindi utilizziamo 10 coppie di primer.

Ogni coppia si appaierà alle due regioni corrispondenti di ciascun gene house-keeping. Dopo aver amplificato (10 amplificati di 400/500pb) effettuiamo il sequenziamento e analizziamo le sequenze. Le piccole variazioni delle sequenze individuano diverse forme alleliche.



Poi si prepara una tabella e si ottiene un codice a 10 cifre che ci permette di individuare il ceppo batterico.

Con la Multilocus sequence typing si classificano i batteri in ceppi utilizzando geni house-keeping

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Autore dell'articolo: Admin

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