Diagnosi molecolare

Quando un paziente mostra dei sintomi ascrivibili ad un’infezione batterica è necessario procedere con la diagnosi microbiologica, che ha l’obiettivo di identificare i patogeni che hanno colpito l’ospite. Si deve procedere, su consiglio del medico, con il prelievo di campioni biologici necessari per eseguire tutte le metodiche di laboratorio.

Abbiamo già parlato della diagnosi microbiologica diretta, in cui si cercano direttamente i batteri o parti di essi all’interno del campione. Anche la diagnosi molecolare è una diagnosi diretta, perché si va alla ricerca del DNA dei batteri patogeni attraverso varie metodiche.



Ricerca degli acidi nucleici

Accompagna la diagnostica colturale perché non sempre si hanno a disposizione terreni adatti alla crescita e all’isolamento di batteri e non sempre si possono rispettare i tempi di crescita poiché eccessivamente lunghi.

Il rapido e continuo sviluppo delle tecniche di biologia molecolare basate sullo studio degli acidi nucleici ha rivoluzionato il campo della diagnostica microbiologica permettendo di raggiungere elevati livelli di sensibilità e specificità.

Vantaggi

Vantaggi delle procedure diagnostiche molecolari:

  • Gli acidi nucleici possono essere isolati dai tessuti infetti.
  • Gli acidi nucleici possono essere visualizzati e misurati.
  • La sequenza nucleotidica d’interesse può essere amplificata per incrementare la quantità di materiale da utilizzare per le successive analisi.
  • La sequenza nucleotidica del genoma di un determinato patogeno è unica e pertanto l’analisi di ibridazione dell’acido nucleico può essere usata per ottenere un’identificazione.

In sintesi con la diagnosi molecolare non si ha la necessità di utilizzare terreni di crescita, di isolare il batterio in forma pura e di aspettare tempi lunghi di crescita.

Questi test sono molto diffusi perché sono dotati di una sempre maggiore specificità perché riusciamo a discriminare tra le specie batteriche grazie alle sequenze nel DNA che codificano per l’rRNA 16s, che sono altamente conservate. Tra batteri di specie diverse, invece, ci sono molte differenze tra le sequenze che codificano per l’rRNA 16s.

Inoltre, i testo molecolari sono anche molto sensibili perché ci danno la possibilità di rilevare quantità molto piccole di DNA.



Campioni biologici per indagini molecolari

Ogni tipo di campione può essere utilizzato:

  • solido (tessuti bioptici, feci);
  • liquido (sangue, liquor, urine, aspirati pleurici e peritoneali);
  • tamponi.

La riuscita dei test molecolari è fortemente condizionata dalla quantità dell’acido nucleico ottenuto nel processo di estrazione. Durante l’estrazione si allontanano le proteine, gli zuccheri ed i lipidi; poi per recuperare gli acidi nucleici (DNA e RNA) si effettua un’estrazione con solventi organici.

I solventi organici sono il fenolo, cloroformio e l’alcol isoamilico.

Tecniche molecolari utilizzate per la diagnosi

  • PCR quando viene estratto il DNA.
  • RT-PCR quando viene estratto l’RNA.
  • PCR quantitativa;
  • Real-Time PCR;
  • Ibridazione degli acidi nucleici.

Schema e funzionamento della PCR



Ibridazione acidi nucleici per la diagnosi

Si estrae il DNA dal campione e si sottopone ad ibridazione con sonde specifiche. Precisamente si prende il campione, si carica/trasferisce su gel e poi lo passa su filtro. Si usa una sonda specifica rappresentata da un frammento di DNA omologo a quello che stiamo cercando nel campione, marcato in vario modo (generalmente con radio isotopi o enzimi). Infine, si effettua una rilevazione autoradiografica a fluorescenza oppure una chemioluminescenza.

Leggi i nostri appunti sull’ibridazione degli acidi nucleici

Libro di testo

Per lo studio della microbiologia applicata potete utilizzare o microbiologia medica, oppure sempre il Brock è un ottimo libro di testo.

 

Autore dell'articolo: Admin

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