Tagli parziali per mappe fisiche di restrizione

Per costruire le mappe fisiche di restrizione di molecole di DNA lunghe complesse è molto utile fare dei tagli parziali sulle molecole, per evitare di ottenere troppi frammenti che renderebbero difficile la costruzione della mappa. Quando parliamo di mappe fisiche facciamo riferimento alla possibilità di ordinare i frammenti che otteniamo dal taglio di una molecola di DNA con gli enzimi di restrizione.



Cosa significa tagli parziali?

I tagli parziali si effettuano in condizioni limitanti di enzima o in condizioni limitanti di digestione. Nel primo caso, nella provetta, aggiungiamo una piccola quantità di enzima, mentre nel secondo caso utilizziamo la giusta quantità di enzima ma riduciamo il tempo di digestione. Ricordiamo che digestione con gli enzimi di restrizione deve essere effettuata a 37° e deve durare due ore (nella eppendorf si aggiunge molecola di DNA, enzima, tampone adatto).

A basse concentrazioni di enzima non tutti i punti di taglio presenti sulla molecola (che sono le sequenze palindromiche) verranno riconosciuti. La soluzione di DNA contiene migliaia di molecole e ognuna verrà tagliata in maniera diverso.

I tagli parziali ottenuti verranno confrontati con i tagli totali, quindi con le digestioni effettuate in condizioni ottimali. Ovviamente per confrontare i frammenti dei vari tagli dobbiamo caricare le digestioni nei pozzetti del gel e sottoporre a gel elettroforesi.
Attraverso questo confronto si trova l’ordine dei vari segmenti e si costruisce la mappa fisica di restrizione.

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Autore dell'articolo: Admin

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