Southern Blotting: metodo idratato e a secco

Il Southern blotting è una tecnica utilizzata per trasferire i frammenti di DNA da un gel di agarosio, dove sono stati separati in base alle loro dimensioni, ad un filtro di nylon. Il filtro poi subirà una serie di processi e infine verrà utilizzato per l’ibridazione.



Per trasferire il DNA da gel a filtro possiamo utilizzare due metodi: uno a secco e uno idratato. In entrambi i casi il gel, prima di essere utilizzato per il Southern blotting, deve subire alcuni trattamenti.

Gel elettroforesi: come funziona questa tecnica?

Trattamenti del gel di agarosio

Terminata la corsa elettroforetica il gel deve essere trattato con una serie di soluzioni. Questi passaggi sono fondamentali per aumentare l’efficienza del trasferimento del DNA dal gel di agarosio alla membrana di nylon.

  1. Soluzione di depurinazione: HCl 0,25M per circa 7 minuti (il tempo dipende dallo spessore e dalla concentrazione del gel).
    La funzione di questo trattamento è di creare dei siti apurinici per rottura del legame N-glicosilico (dove sono presenti le purine). La frammentazione del DNA aumenta l’efficienza del trasferimento senza pregiudicare né la successiva ibridazione né la valutazione della lunghezza dei frammenti, in quanto sono già migrati e sono stati già separati in base alle loro dimensioni.
    Ad oggi questo trattamento viene effettuato molto raramente e solo se si lavora con DNA ad alto PM perché la procedura del Southern Blotting è stata migliorata e ottimizzata.
    Ricordiamo che il legame N-glicosidico è il legame che tiene insieme la base azotata e lo zucchero, che nel DNA è il deossiribosio (ripassa la struttura delle basi azotate cliccando qui).
  2. Soluzione di denaturazione: NaCl 1,5M e NaOH 0,5M.
    La funzione di questo trattamento è quella di denaturare la doppia elica del DNA per ottenere molecole a singolo filamento che saranno indispensabili per la successiva ibridazione con la sonda marcata. Il pH alcalino e una concentrazione salina adeguata permettono la rottura dei legami a idrogeno che si instaurano tra i due filamenti.
  3. Soluzione di neutralizzazione: NaCl 1,5M e Tris 0,5M.
    Questo passaggio ha la funzione di riportare il pH del gel alla neutralità, dato che in condizioni basiche il DNA viene trasferito meno efficacemente su membrana di nylon. Questa operazione può anche essere omessa.

Dopo ogni soluzione sarebbe opportuno sciacquare il gel in acqua bidistillata.



Southern Blotting metodo idratato

Si allestisce un sistema costituito da una vaschetta contenente il tampone di trasferimento (un tampone con elevata forza ionica). Si pone un supporto rivestito con carta Whatman (carta da filtro) i cui lembi pescano nel tampone presente nella vaschetta. Tutta la carta da filtro, quindi, sarà bagnata dal tampone di trasferimento.

Sulla carta si poggia il gel e sul gel il filtro di nylon (l’adesione deve essere perfetta). Sul filtro si poggiano 3-4 foglietti di carta da filtro e dei tovaglioli di carta. Sopra i tovaglioli si aggiunge un peso da 1 Kg.

Si lascia il sistema per 12 ore per permettere al tampone di salire per capillarità. Il tampone, salendo per raggiungere i tovaglioli di carta, trascina con se il DNA che rimane intrappolato nelle maglie del filtro esattamente nella stessa posizione in cui si trovava sul gel. Con questa tecnica da un gel si ottiene un solo filtro, che poi subirà i processi di lavaggio e di “cottura” a 80°.

Southern Blotting metodo a secco

In questa tecnica si allestisce un sistema a sandwich e da un gel si ottengono due filtri.

Sulla scrivania del laboratorio si mette una pila di tovagliolini asciutti, 3-4 fogli di carta da filtro asciutti, il primo filtro di nylon detto filtro button e infine il gel (che come al solito deve aderire perfettamente al filtro, evitando la formazione di bolle d’aria). Sul gel si mette un altro filtro, detto filtro top, e di nuovo 3-4 fogli di carta da filtro e una pila di tovaglioli asciutti. Sopra si poggia sempre un peso da 1 Kg.

Si lascia sempre il sistema per una notte per fare in modo che il tampone di elettroforesi (che è rimasto nelle maglie del gel) si muova:

  • verso il basso per gravità e capillarità;
  • verso l’alto per capillarità.

Grazie a questo movimento il tampone trascina con se il DNA che rimane intrappolato tra le maglie dei filtri button e top. Da un gel otteniamo due filtri speculari di cui uno più carico di DNA (il button).



Questa tecnica può essere utilizzata solo se abbiamo a disposizione una sufficiente quantità di DNA per ottenere due filtri utilizzabili per le ibridazioni. Leggi i nostri appunti sull’ibridazione

Come al solito i filtri ottenuti subiranno dei lavaggi per eliminare tracce di tampone e di agarosio e poi verranno cotti a 80° per due ore. Come avvengono i lavaggi? Leggi i nostri appunti

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Autore dell'articolo: Admin

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