Marcatura terminale del DNA in 5′ e 3′

Abbiamo già detto, nei precedenti appunti, che per costruire le mappe fisiche di regioni del DNA si utilizzano gli enzimi di restrizione per effettuare digestioni parziali o totali (cliccando sui link troverai tutte le informazioni).

Quando dobbiamo costruire le mappe fisiche di restrizione di molecole più complesse un altro approccio è quello di marcare le estremità delle molecole con delle sostanze radioattive. Dopo aver marcato il DNA esso viene tagliato con gli enzimi di restrizione e i frammenti vengono sottoposti a gel elettroforesi. In questo modo possiamo capire quali sono i frammenti che si trovano alle due estremità della molecola.



La marcatura può essere effettuata sia a livello delle estremità 5′ fosfato sia a livello delle estremità 3′ OH.

Marcatura in 5′

Innanzitutto bisogna rimuovere il “fosfato freddo” tramite una fosfatasi alcanica lasciando sull’estremità 5′ il gruppo OH. ll fosfato eliminato deve essere rimpiazzato con il P32 in una reazione di fosforilazione catalizzata dalla deossiribonucleotide chinasi. La reazione avviene in presenza di un precursore che ha il fosfato marcato in gamma (l’ultimo fosfato) e di solito è l’ATP.

Schema della marcatura del DNA in 5'

Marcatura in 3′

Bisogna creare delle estremità 3′ recessive usando un’esonucleasi 3′ che, in condizioni controllate, comincia a degradare dai due filamenti alcuni nucleotidi partendo dall’estremità 3′ OH. Ricordiamo che le esonucleasi degradano i filamenti di DNA a partire dalle due estremità e si dividono in:

  • Esonucleasi che degradano a partire dall’estremità 3′ OH;
  • Esonucleasi che degradano a partire dall’estremità 5′ P.

Leggi i nostri appunti sulle nucleasi

A questo punto si aggiunge alla miscela di reazione la DNA polimerasi 1 che in presenza dei 4 precursori (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) allunga il filamento che presenta l’estremità recessive. Dei quattro precursori almeno uno deve essere marcato con P32 sul fosfato in alfa (il primo fosfato), perché l’attacco nucleofilo catalizzato dalla DNA polimerasi avviene tra il gruppo OH dell’estremità 3′ e il fosfato in alfa del precursore.

Trovare le estremità della molecola

Dopo aver marcato la molecola di DNA con uno dei due metodi proposti bisogna procedere alla digestione con gli enzimi di restrizione. Ottenuti i frammenti essi vanno sottoposti a gel elettroforesi e, infine, facciamo un’autoradiografia al gel.

Per fare l’autoradiografia si mette a contatto del gel una lastra autoradiografica e si lascia a contatto per un intervallo di tempo che dipende dall’intensità della radioattività (che si misura con uno specifico strumento).



In camera buia la lastra autoradiografica viene immersa nel liquido di sviluppo e poi nel liquido di fissaggio. Sulla lastra appariranno solo le estremità della molecola (perché sono radioattive) di cui possiamo calcolare il numero di paia di basi confrontando la loro migrazione rispetto a quella dei frammenti marker a peso molecolare noto.

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Autore dell'articolo: Admin

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