Lavaggi dei filtri e stripping

Abbiamo parlato nei precedenti appunti dell’ibridazione su supporto e del Southern Blotting, una tecnica che ci permette di trasferire i frammenti di DNA dal gel di agarosio adun filtro di nylon.

Una volta effettuato il trasferimento degli acidi nucleici vengono fatti i processi di pre-ibridazione e di ibridazione. A questo punto la sonda avrà ibridato con i frammenti con cui ha trovato un’elevata similarità e, per vedere quali sono, bisogna esporre il filtro ad autoradiografia.
C’è però la possibilità che la sonda abbia ibridato anche con dei frammenti non altamente specifici, quindi per evitare di trovare dei falsi positivi è necessario effettuare dei lavaggi prima dell’autoradiografia.



Lavaggi dei filtri e stringenza

I filtri, dopo il processo di ibridazione, subiscono dei lavaggi a stringenza crescente, cioè ad elevate temperature o a elevate concentrazioni saline. Questi lavaggi servono a dissociare gli ibridi poco stabili mentre, anche in condizioni di elevata stringenza, gli ibridi stabili (quelli altamente specifici) non vengono dissociati.
A questo punto si può procedere con l’autoradiografia. Prima di mettere in camera buia si misura la radioattività del filtro (con uno strumento chiamato geiger) per decidere il tempo dell’esposizione autoradiografica. Poi la lastra viene immersa nel liquido di sviluppo e nel liquido di fissaggio.

Lettura della lastra autoradiografica e stripping

Sulla lastra appariranno delle bande nere che corrispondono ai frammenti di DNA che hanno ibridato con la sonda radioattiva. Se l’autoradiografia è ben leggibile lo stesso filtro viene ri-utilizzato per delle nuove ibridazioni.

Per riutilizzare un filtro si fa lo stripping: viene immerso in acqua bollente e in queste condizioni di stringenza elevatissima anche gli ibridi stabili si dissociano.

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Autore dell'articolo: Admin

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