Gel elettroforesi: separare i frammenti di DNA

Per costruire una mappa fisica di restrizione, dopo aver tagliato una molecola di DNA con gli enzimi di restrizione, è necessario trovare le dimensioni di ogni frammento e per farlo si utilizza la tecnica dell’elettroforesi su gel.

Rappresentazione della camera di elettroforesi
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Cos’è il gel

Il gel si ottiene da una soluzione di agarosio all’1% che viene portata ad ebollizione e, ancora calda, viene versata in un vassoio dove raffreddandosi solidifica. In base alla dimensione dei frammenti di DNA si possono usare dei gel anche con concentrazioni di agarosio pari allo 0,5%.

Allestimento della tecnica

Dopo aver versato la soluzione di agarosio nel vassoio si aggiunge un pettine (in verticale rispetto al piano del vassoio) i cui dentini si immergono, non completamente, nella soluzione di agarosio che si sta solidificando. Il pettine viene poi eliminato e nel gel, che ormai si è solidificato, troviamo dei pozzetti che verranno utilizzati per caricare il campione da sottoporre a gel elettroforesi.



Nel frattempo si allestisce la digestione e il DNA viene incubato per 2 ore a 37° con l’enzima di restrizione scelto. Solitamente 1µg di DNA viene digerito con 1µg di enzima in presenza del tampone specifico. Nella provetta si aggiunge anche l’acqua per arrivare al volume totale di 20µl.

Affinché la digestione avvenga il maniera ottimale i volumi devono essere molto piccoli per evitare di diluire troppo il DNA e gli enzimi di restrizione.

Struttura di una vasca di elettroforesi
Fonte: elettroforesi.weebly.com

Il vassoio con il gel viene posto al centro della celletta di elettroforesi che contiene il tampone di elettroforesi che ricopre tutto il sistema (ovviamente anche il gel è immerso nel tampone). Nelle due cellette ci sono i due elettrodi che sono collegati ad un alimentatore che crea una differenza di potenziale nel gel.
Terminata l’incubazione la soluzione con il DNA tagliato dall’enzima di restrizione viene caricata nei pozzetti e può cominciare la corsa elettroforetica.

Migrazione dei frammenti di DNA

I pozzetti nel gel devono stare dalla parte dell’elettrodo negativo perché il DNA, avendo cariche negative, migra verso il polo positivo. Insieme al campione, nei pozzetti accanto, carichiamo dei frammenti di DNA detti marker. I marker sono dei frammenti di cui conosciamo il peso molecolare o il numero di paia di basi.

Leggi anche: la doppia elica del DNA

Quando accendiamo l’alimentatore comincia la migrazione dei frammenti di DNA tra le maglie del gel che rallentano la migrazione elettroforetica dei frammenti più grandi. I frammenti più piccoli, quindi, migrano più velocemente dei frammenti più grandi.



Per seguire la migrazione e capire quando stoppare l’alimentatore si aggiunge alla soluzione di DNA un colorante aspecifico, il blu di bromofenolo. Questo colorante viene utilizzato come “marcatore di corsa“: non ha alcuna affinità con il DNA ma essendo una molecola piccola e carica negativamente migra anch’essa verso il polo positivo, ma più velocemente del DNA. Il blu di bromofenolo, che si vede come una banda blu all’interno del gel, ci permette di controllare la migrazione e prima che la banda blu fuoriesca e si disperda nel tampone viene interrotta la corsa elettroforetica.

Visualizzare la migrazione del DNA

Il gel viene immerso in una soluzione di etidiobromuro che, come già sappiamo dai precedenti appunti, “colora” il DNA essendo un agente intercalante (tutte le informazioni sono presenti cliccando sul link sopra). Il gel viene posto su un trans-illuminatore a raggi UV, viene irradiato e il DNA apparirà come bande rossastre. Si scatta una fotografia per misurare la migrazione di tutti i frammenti, sia di quelli incogniti sia dei marker.

Relazione tra migrazione e grandezza dei frammenti

Insieme ai frammenti incogniti, ottenuti tramite la digestione di molecole di DNA con gli enzimi di restrizione, abbiamo fatto migrare anche dei frammenti marker di cui conosciamo il numero di paia di basi. In questo modo possiamo costruire una retta di calibratura e risalire alle dimensioni dei frammenti incogniti tramite la migrazione dei frammenti marker.



Tra i cm di migrazione e il numero di paia di basi dei frammenti (quindi la lunghezza) c’è una relazione di tipo semi-logaritmico, in cui la migrazione è inversamente proporzionale al logaritmo del numero di paia di basi.
Avendo i marker e conoscendo la loro migrazione costruiamo il grafico in cui sull’ascissa mettiamo i cm di migrazione e sull’ordinata mettiamo il loro peso molecolare. Abbiamo ottenuto la retta di calibratura e, conoscendo la migrazione dei frammenti incogniti, per interpolazione sul grafico ricaviamo la lunghezza dei frammenti.

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Autore dell'articolo: Admin

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