Enzimi di restrizione usi e mappe fisiche

I virus sono entità biologiche che infettano i batteri iniettando all’interno della cellule il loro materiale genetico. Quello che accade è che, sfruttando il macchinario dei batteri, il materiale genetico viene duplicato, trascritto e tradotto e ciò porta alla formazione di nuove particelle virali. Queste particelle provocano la lisi delle cellula batterica e quindi la sua morte.

Alla fine degli anni Sessanta del Novecento si scoprì che alcuni batteri si difendono dall’attacco dei virus producendo particolari enzimi, denominati enzimi di restrizione, che tagliano le molecole di DNA estraneo riducendole in frammenti più piccoli, non infettanti.



Gli enzimi di restrizione vengono utilizzati in biologia molecolare per diversi esperimenti e appartengono alla classe degli enzimi detti nucleasi.

Vari tipi di nucleasi

In questa classe di enzimi distinguiamo:

  • Ribonucleasi: tagliano filamenti di RNA.
  • Deossinucleasi: tagliano filamenti di DNA.
  • Endonucleasi: tagliano RNA o DNA all’interno della molecola.
  • Esonucleasi: tagliano RNA o DNA partendo dall’estremità 5’ oppure da quella 3’.

Leggi i nostri appunti sulla struttura del DNA

Enzimi di restrizione: funzionamento e diversi tipi di taglio

Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi che tagliano solo il DNA perché possono tagliare solo molecole duplex e non singoli filamenti (non sono attivi sull’RNA). Il taglio ovviamente avviene a livello del legame fosfodiesterico tra due nucleotidi successivi.

Questi enzimi riconoscono e tagliano specifiche sequenze dette sequenze palindromiche: sono sequenze di DNA che lette in direzione 5’-3’ e in direzione 3’-5’ mostrano una completa complementarietà. Un esempio è la sequenza GAATTC (letta 5’-3’) che è uguale a CTTAAG (letta 3’-5’), che viene tagliata da uno specifico enzima di restrizione presente in E. Coli. Le sequenze palindromiche contengono massimo dalle 4 alle 8 paia di basi.

Gli enzimi si differenziano non solo per la specificità e per la lunghezza delle sequenze di riconoscimento, ma anche per il tipo di estremità che generano.

Il taglio può formare estremità piatte oppure estremità sfalsate. Nel primo caso avviene un taglio netto che porta alla formazione di due estremità non appiccicose, nel secondo caso avviene un taglio sfalsato che porta alla formazione di due estremità appiccicose dette anche coesive o sticky.



Estremità appiccicose e non appiccicose

L’enzima EcoRI taglia i legami covalenti tra la guanina e l’adenina in posizioni diverse su ciascun filamento della doppia elica. I legami a idrogeno tra le quattro coppie di basi che si trovano tra i due tagli si rompono facilmente portando alla formazione di due frammenti con l’estremità 5’ che protrude della lunghezza di quattro nucleotidi.
Queste estremità sono tra loro complementari e vengono dette appiccicose perché si riuniscono facilmente mediante l’appaiamento delle basi sulla stessa molecola o su molecole diverse tagliate con lo stesso enzima. Riparleremo di questa proprietà quando tratteremo l’argomento del clonaggio.

Esempio di taglio di un enzima di restrizione
Fonte: chimica-online.it

Enzimi a protezione dei batteri

Abbiamo già detto che i batteri utilizzano questi enzimi per difendersi dai fagi. In pratica tagliano il DNA dei virus in tanti piccoli frammenti rendendolo inattivo. Ma, se gli enzimi di restrizione tagliano il DNA, come fanno i batteri a proteggere il loro materiale genetico?

I batteri si difendono metilando le basi presenti nei siti di restrizione perché alcuni di questi enzimi sono sensibili alla metilazione, nel senso che la presenza di un metile nel sito di riconoscimento ne inibisce l’attività.



Mappe fisiche di restrizione

Gli enzimi di restrizione servono a ridurre le dimensioni di grandi molecole di DNA e, definendo i siti di taglio in una molecola, possiamo costruire le mappe fisiche di restrizione.
Le varie sequenze ottenute dalla digestione del DNA con le endonucleasi vengono separate tramite gel elettroforesi in base alle loro dimensioni. Dopo aver definito le dimensioni possiamo ordinare i frammenti sulla molecola.

Leggi i nostri appunti sulla gel elettroforesi

Le mappe fisiche di restrizione sono molto migliori delle mappe genetiche perché hanno un potere risolutivo maggiore:

  • Un’unità di mappa nelle mappe genetiche corrisponde a 106
  • Nelle mappe fisiche di restrizione l’unità di misura è invece il paio di basi.

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Autore dell'articolo: Admin

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