Clonaggio nei cosmidi: frammenti da 35-45k basi

Il clonaggio è una tecnica di biologia molecolare molto utilizzata perché permette di amplificare, all’interno di alcuni vettori di clonaggio, dei frammenti di DNA da studiare.

Sappiamo che ci sono vari vettori di clonaggio:

  • Plasmidi, di cui abbiamo parlato nei precedenti appunti (PBR e pUC)
  • Fago lambda
  • Cosmidi
  • YAC



In questi appunti parleremo del clonaggio nei cosmidi. Con questa tecnica è possibile clonare frammenti di DNA di circa 35-45k basi.

Struttura del cosmide

Il cosmide è un vettore plasmidico artificiale impiegato nelle tecniche di clonaggio tipiche della biologia molecolare. E’ molto simile ad un plasmide perché ha una forma circolare ed è caratterizzato da:

  • Un sito che conferisce la resistenza ad un antibiotico, che può essere anpicillina o tetraciclina.
  • Un sito ORI da cui può cominciare la replicazione.
  • Un sito cos che è una regione del genoma del fago lambda che corrisponde alla regione in cui si legano il braccio sinistro e braccio destro (sopra trovate il link per leggere gli appunti precedenti).

Grazie ai cosmidi siamo in grado di clonare frammenti di 35-45k di basi.

Preparazione del DNA genomico da clonare

Il DNA genomico da analizzare viene digerito con una digestione parziale con l’enzima di restrizione BAM H1. Tutti i frammenti ottenuti vengono sottoposti a gel elettroforesi su gel di agarosio e vengono selezionati e prelevati dal gel solo i frammenti lunghi 35-45000 paia di basi.



Digestione del cosmide e ligazione

Le molecole del cosmide vengono digerite con l’enzima di restrizione BAM H1 che effettua un solo taglio. Le estremità appiccicose generate dal taglio con l’enzima di restrizione una volta messe ad incubare con la DNA ligasi in presenza di molecole energetiche formano un concatenato di DNA.

In quest’immagine, trovata qui, abbiamo un riassunto di tutto ciò che abbiamo detto finora.

Clonaggio utilizzando i cosmidi

Impacchettamento in vitro

Si effettua l’impacchettamento in vitro incubando il ligato (concatenato di DNA) con un estratto di tutte le proteine fagiche. Una proteina della testa del fago riconosce la regione cos e taglia, formando una singola unità che contiene un solo frammento di DNA genomico.

Le singole unità contengono, oltre al frammento di 45k basi da studiare, anche le estremità di due regioni cos, fondamentali per la successiva ricorcolarizzazione del cosmide.

Nella particella fagica ricombinante, quindi, non sono presenti geni del fago ma solo DNA genomico da analizzare e studiare.



Infezione su E.1 Coli senza ciclo litico

Con le particelle fagiche si infettano delle colonie di E. Coli e il DNA ricombinante entra nella cellula ma non può avvenire il ciclo litico, perché non è presente alcun gene del fago.
Il DNA ricombinante entra lineare ma si chiude su se stesso a livello delle regioni cos. Il DNA ricombinante quindi, possedendo la regione ORI, si replica come se fosse un plasmide.

Le varie colonie batteriche vengono poi sottoposte a screening.

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Autore dell'articolo: Admin

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