Clonaggio in plasmidi pUC

Il clonaggio fu una tecnica innovativa perché permetteva di ottenere miliardi di molecole di DNA, tutte uguali, su cui lavorare per effettuare studi su specifici geni. I primi vettori di clonaggio furono i plasmidi, che vennero purificati da batteri.



Cosa sono i plasmidi?

plasmidi sono piccoli filamenti circolari di DNA superavvolto a doppia elica, presenti nel citoplasma e distinguibili dal cromosoma batterico per le loro dimensioni ridotte. Vengono utilizzati come vettori di clonaggio perché sono in grado di replicarsi indipendentemente dal cromosoma batterico, in quanto possiedono un’origine di replicazione e una terminazione di replicazione.

I plasmidi pUC

I plasmidi pUC sono dei vettori di clonaggio molto più versatili rispetto ai PBR perché sono più piccoli e contengono molti siti di restrizione unici. I plasmidi pUC hanno due geni che rivestono una particolare importanza per il clonaggio:

  • Un gene che conferisce la resistenza all’anpicillina
  • Il gene LacZ che codifica per l’enzima beta-galattosidasi. Questo enzima idrolizza il legame beta 1-4 del lattosio.



All’interno del gene Lac Z i ricercatori hanno inserito una sequenza di circa 100 nucleotidi detta poli-linker, che contiene 20 siti di restrizione unici.

All'interno del polylinker ci sono tanti siti di restrizione unici
Fonte: wikipedia

Screening bianco-blu

Come spiegato nei precedenti appunti sul clonaggio in PBR anche in questo caso il plasmide pUC viene tagliato con lo stesso enzima con cui viene tagliata da molecole di DNA da cui voglio ottenere i frammenti da clonare. Poi si procede alla ligazione e alla trasformazione delle cellule batteriche competenti.

Leggi anche: come avviene la trasformazione?

Le cellule trasformate vengono seminate su piastra Petri e, con questo metodo, non ho bisogno di fare altre selezioni per distinguere i plasmidi ricombinanti da quelli ricircolarizzati.

Il terreno solido, oltre a contenere l’anpicillina, contiene anche una sostanza che presenta un legame come quello del lattosio. Questa sostanza è detta X-gal (abbreviato anche in BCIG per bromo-cloro-indolil-galattopiranoside) ed è un composto organico consistente in una molecola di galattosio legata ad un indolo sostituito.

E’ una sostanza cromogena che sviluppa colore quando viene idrolizzato il legame: l’indolo viene liberato e colora di blu le cellule batteriche dove è avvenuta la reazione.

Molecole di X-GAL
Fonte: wikipedia

L’anpicillina ci permette di visualizzare su piastra solo le colonie che hanno incorporato il plasmide, perché le cellule batteriche non trasformate non possono crescere in presenza di questo antibiotico.
Adesso dobbiamo distinguere le cellule che hanno inglobato il plasmide ibrido da quelle che hanno incorporato il plasmide ricircolarizzato.

I cloni blu sono i negativi, mentre i bianchi sono i positivi cioè quelli che hanno al loro interno il plasmide ibrido contenente il frammento di DNA che vogliamo studiare. Nei cloni bianchi si è verificata un’inattivazione inserzionale: il gene per la beta galattosidasi non funziona più perché c’è un pezzo di DNA di un altro organismo.



Grazie a questa tecnica siamo riusciti ad ottenere milioni di copie dei frammenti di DNA che vogliamo studiare, perché il plasmide si è replicato insieme al cromosoma batterico.

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Autore dell'articolo: Admin

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