Clonaggio in plasmidi PBR

Il clonaggio fu una tecnica innovativa perché permetteva di ottenere miliardi di molecole di DNA, tutte uguali, su cui lavorare per effettuare studi su specifici geni. I primi vettori di clonaggio furono i plasmidi, che vennero purificati da batteri.

Cosa sono i plasmidi?

plasmidi sono piccoli filamenti circolari di DNA superavvolto a doppia elica, presenti nel citoplasma e distinguibili dal cromosoma batterico per le loro dimensioni ridotte.

Vengono utilizzati come vettori di clonaggio perché sono in grado di replicarsi in maniera indipendente dal cromosoma batterico, in quanto possiedono un’origine di replicazione e una terminazione di replicazione.



I plasmidi PBR

I primi plasmidi utilizzati per il clonaggio furono i PBR, che però sono poco versatili e di grandi dimensioni. Sono poco versatili perché possiedono pochi siti di restrizione per il clonaggio: un sito è adatto solo se è presente una sola volta nella molecola. Cosa sono i siti di restrizione? Sono delle sequenze di DNA riconosciute da un enzima di restrizione.

I plasmidi PBR posseggono due geni che gli conferiscono una resistenza agli antibiotici:

  • Un gene per l’anpicillina.
  • Un gene per la tetraciclina, che è il gene per la selezione.
Struttura e sequenze del plasmide pBR322
Siti di restrizione dei plasmidi PBR Fonte: wikipedia

L’enzima di restrizione BAM H1 effettua un taglio sfalzato a livello di una sequenza palindromica presente nel gene che conferisce la resistenza alla tetraciclina. Se i plasmidi vengono digeriti da questo enzima di restrizione si passa da DNA circolare a DNA lineare.
Anche il frammento che vogliamo clonare viene digerito con BAM H1, in modo da ottenere delle estremità appiccicose che si possono appaiare.



Formazione del ligato

Nella provetta che contiene i plasmidi e i frammenti tagliati con BAM H1 si aggiunge l’enzima DNA ligasi e ATP. In queste condizioni i legami a idrogeno che si formano tra le estremità coesive (che si appaiano perché sono complementari) diventano covalenti e si forma il legame fosfodiesterico. Questo processo viene detto ligazione ed avviene a 18° per 12 ore, portando nuovamente alla formazione di molecole circolari (il ligato).

Nel provetta del ligato sono presenti due molecole diverse:

  • Molecole dove è avvenuta l’inserzione: sono i plasmidi ricombinanti.
  • Molecole ricircolizzate, in cui si è riformato il plasmide originale.

Adesso è necessario inserire il ligato nelle cellule batteriche, dove avverrà la replicazione del plasmide. Il ligato viene incubato con cellule batteriche competenti ed avviene la trasformazione: cioè l’ingresso di materiale genetico (plasmide ricombinante o ricircolarizzato) nelle cellule batteriche.

Leggi anche: come avviene la trasformazione?

Screening dei plasmidi ricombinanti e ricircolarizzati: inattivazione inserzionale

Le cellule batteriche, dopo la trasformazione, vengono seminate su un terreno solido che contiene l’anpicillina.
La presenza dell’anpicillina ci permette di distinguere le cellule trasformate da quelle non trasformate:

  • Le cellule trasformate, che contengono il plasmide (ancora non sappiamo se contengono quello ibrido o quello ricircolarizzato), crescono su questa piastra perché hanno il gene per la resistenza all’anpicillina.
  • Le cellule non trasformate, non contenendo il plasmide, non sono resistenti all’anpicillina e non crescono.



A questo punto bisogna fare un’ulteriore selezione per distinguere le cellule che possiedono il plasmide ricircolarizzato e quelle che contengono il plasmide ibrido. Con un tampone di velluto preleviamo le colture batteriche dalla piastra madre e successivamente poniamo il velluto prima su una piastra che contiene tetraciclina e poi su una piastra con anpicillina.

  • Sulla piastra con tetraciclina le cellule che contengono il plasmide ricombinante non crescono, perché la funzionalità del gene è compromessa. Si parla di inattivazione inserzionale, perché il frammento che abbiamo clonato è stato inserito all’interno del gene che permetteva la resistenza alla tetraciclina (che non funziona più).
  • La semina su una seconda piastra con anpicillina è utilizzata come controllo, per essere certi che il trasferimento sia avvenuto correttamente. Su questa piastra dobbiamo trovare le stesse colonie presenti sulla piastra madre.

Le colonie presenti sulla piastra con anpicillina e assenti sulla piastra con tetraciclina sono quelle che posseggono il plasmide ricombinante.

Il clonaggio nei plasmidi PBR è molto complesso e lungo perché richiede una replica su un’altra piastra con anpicillina. Nel clonaggio con plasmidi pUC, invece, non serve nessuna piastra come controllo.

Grazie a questa tecnica siamo riusciti ad ottenere milioni di copie dei frammenti di DNA che vogliamo studiare, perché il plasmide si è replicato insieme al cromosoma batterico.

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Autore dell'articolo: Admin

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