Clonaggio in fago lambda: frammenti da 15k basi

Il clonaggio è una tecnica di biologia molecolare molto utilizzata perché permette di amplificare, all’interno di alcuni vettori di clonaggio, dei frammenti di DNA da studiare.

Sappiamo che ci sono vari vettori di clonaggio:

  • Plasmidi, di cui abbiamo parlato nei precedenti appunti (PBR e pUC)
  • Fago lambda
  • Cosmidi
  • YAC



In questi appunti parleremo del clonaggio in fago lambda. Con questa tecnica è possibile clonare frammenti di DNA di circa 15k basi.

Genoma del fago

Si utilizza il genoma di questo fago come vettore di clonaggio. E’ un genoma lineare e a doppio filamento lungo 45k basi. Quando questo genoma viene tagliato con l’enzima di restrizione BAM H1 viene diviso in 3 parti:

  • Braccio sinistro
  • Frammento centrale
  • Braccio destro

Ai fini del clonaggio vengono conservati i due bracci, mentre il frammento centrale viene scartato.

Clonaggio usando il genoma del fago lambda
Fonte: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=28920

Digestione del DNA genomico

Si fa una digestione parziale con Sau 3A del DNA genomico che vogliamo analizzare. Di tutti i frammenti ottenuti eliminiamo quelli troppo grandi e quelli troppo piccoli e isoliamo dal gel solo i frammenti di circa 15k basi.

Ovviamente sia il DNA genomico che il DNA fagico dopo il taglio con gli enzimi di restrizione devono essere sottoposti a gel elettroforesi. Dal gel poi isoliamo solo quello che ci serve per i passaggi successivi.



Ligato DNA fagico-DNA genomico

Si fa avvenire la ligazione tra il DNA fagico e i frammenti di 15k del DNA genomico. Anche se gli enzimi di restrizione utilizzati sono diversi essi generano comunque delle estremità appiccicose che sono compatibili.

Il prodotto della ligazione sarà un concatenamero: una lunga molecola alternata costituita in ordine da braccio sinistro/frammento di DNA genomico/braccio destro/braccio sinistro/frammento di DNA genomico/braccio destro ecc. Il braccio destro del DNA fagico si lega al braccio sinistro perché le sporgenze sono tra loro compatibili.

Impacchettamento in vitro

Il lungo concatenato viene incubato con un estratto che contiene tutte le proteine fagiche. Una specifica proteina ha la proprietà di tagliare la molecola in singole unità, perché è in grado di riconoscere il punto di giunzione tra il braccio destro e il braccio sinistro. In questo modo ogni unità viene incapsulata in una particella fagica che viene detta ricombinante.

Con tutte le particelle fagiche ricombinanti abbiamo quindi la genoteca completa del genoma che vogliamo studiare.

Infezione su E. Coli e ciclo litico

A questo punto infettiamo delle colonie di E. Coli con le particelle fagiche ricombinanti.

I fagi con la coda si legano alle cellule batteriche iniettando all’interno il loro genoma e avviene il ciclo litico. Ma la domanda che ci poniamo è: se abbiamo rimosso una parte del genoma fagico, come è possibile che avviene il ciclo litico?



Perché la regione centrale che abbiamo eliminato contiene i geni necessari per far avvenire il ciclo lisogeno, e non il ciclo litico.

Avvenuta la lisi delle cellule batteriche il ricercatore preleva la placca dove ci saranno migliaia di fagi. In questo modo si potranno studiare e analizzare i frammenti di DNA genomico.

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Autore dell'articolo: Admin

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