Centrifugazione isopicnica

Il DNA, tra le sue tante proprietà, ha anche quella di sedimentare in un gradiente isopicnico di cloruro di cesio. Se nella provetta dove è presente il gradiente aggiungiamo il DNA, dopo la centrifugazione sedimenta esattamente nella regione del gradiente che ha la sua stessa densità.

Vediamo le caratteristiche principali della centrifugazione isopicnica e per cosa è stata utilizzata.

Fonte: enricocastello.info



Centrifugazione: funzione e meccanismo

La centrifugazione consente la separazione di molecole e particelle sulla base del loro differente comportamento in un campo gravitazionale. Nella ricerca scientifica si distinguono due tipi di centrifugazioni:

  • La centrifugazione preparativa: serve per separare i componenti in una soluzione e per estrarre solo quello che serve per le analisi successive. Se ad esempio voglio lavorare sui mitocondri per prima cosa dovrò separare dalla soluzione, tramite una prima centrifugazione, tutti gli altri organelli.
  • La centrifugazione analitica: serve per lo studio dei componenti estratti dopo la centrifugazione preparativa.

I metodi preparativi possono essere di diversi tipi in base a ciò che dobbiamo ottenere.

Centrifugazione isopicnica, DNA e replicazione

La centrifugazione in gradiente di densità sfrutta le differenze di dimensioni, forma e densità delle particelle che devono essere separate. Il gradiente di densità viene preparato a partire da:

  • Sali di metalli pesanti, come il CsCl
  • Piccole molecole organiche come il saccarosio
  • Polimeri sintetici come il ficoll
  • Silice colloidale come il percoll

Per le tecniche di biologia molecolare noi faremo sempre riferimento al gradiente ottenuto dal cloruro di cesio. Il gradiente di densità si forma tramite l’ultracentrifugazione e può essere di due tipi:

  • Continuo se la densità del soluto cresce in maniera graduale lungo il tubo da centrifuga.
  • Discontinuo se la densità cresce in modo discontinuo per effetto della stratificazione di soluzioni di densità crescente.

Per la costruzione di questi due gradienti sono utilizzati due dispositivi diversi.



Il gradiente di densità continuo è stato utilizzato per calcolare la densità del DNA ma anche per capire il meccanismo con cui avviene la replicazione. Meselson e Stalh, infatti, utilizzarono un gradiente di densità per studiare il processo di replicazione del DNA.

Insieme al DNA, nella provetta dove è presente il gradiente, si aggiunge anche l’etidiobromuro che è un agente intercalante (si intercala tra le basi del DNA) e fluorescente che, se irradiato con luce UV, dà una banda rossastra nella radiazione del visibile. In pratica la banda rossastra che vediamo nella provetta rappresenta il punto esatto in cui ha sedimentato il DNA.

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Autore dell'articolo: Admin

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