Cellule competenti e trasformazione

Il clonaggio fu una tecnina innovativa che ha permesso ai biologi molecolari di studiare particolari regioni di un genoma. I primi vettori di clonaggio furono i plasmidi, all’interno dei quali venivano aggiunti dei pezzi di DNA da amplificare e successivamente studiare.



Abbiamo già visto nei precedenti appunti sul clonaggio in PBR e in pUC come si arriva alla formazione del ligato, che deve essere inserito all’interno di cellule batteriche rese competenti. In  questi appunti vedremo i trattamenti necessari per rendere le cellule competenti e le condizioni sperimentali necessarie per far avvenire la trasformazione.

Cellule batteriche competenti

Terminata la ligazione (tra plasmide e frammento di DNA che presentano estremità coesive) per proseguire con la tecnica del clonaggio è necessario inserire il plasmide ricombinante (che ha il frammento di DNA da clonare) all’interno delle cellule batteriche, dove può duplicarsi. Per far entrare il ligato le cellule batteriche deve essere rese competenti, cioè idonee per accettare materiale genetico.

Il trattamento che subiscono è molto semplice: vengono incubate con cloruro di calcio 0,1 M in ghiacchio per un’ora. A questo punto le cellule batteriche diventano competenti e si può procedere con la trasformazione.

La trasformazione delle cellule competenti

Le cellule batteriche competenti vengono messe ad incubare con il ligato per un’ora in ghiaccio. Poi la provetta subisce uno shock termico a 37° per 5 minuti.



In questo modo avviene la trasformazione, cioè l’ingresso del plasmide nelle cellule. Lo shock termico aumenta l’efficienza della trasformazione. Non si è ancora capito per quale motivo lo shock termico faciliti l’ingresso del materiale genetico nei batteri (è un’osservazione empirica).

Con quale meccanismo avviene la trasformazione?

Sebbene il meccanismo con cui il DNA viene “catturato” dalle cellule non sia noto si suppone che le cariche degli ioni calcio schermino le cariche negative del DNA, permettendogli di passare attraverso la membrana plasmatica. Per questo motivo, prima della trasformazione, le cellule vengono rese competenti attraverso un trattamento con cloruro di calcio.

Efficienza della trasformazione

La trasformazione è un processo relativamente inefficiente e solo una piccola percentuale delle cellule incubate con il ligato catturerà il plasmide. Proprio per questo motivo la selezione con l’antibiotico (che nei plasmidi PBR e pUC viene fatta con l’anpicillina) è necessaria per separare le cellule che hanno incorporato il plasmide da quelle che non lo hanno incorporato (cellule trasformate e cellule non trasformate).



L’inefficienza del processo inoltre assicura che nella maggior parte delle cellule trasformate venga incorporato un solo plasmide, quindi un solo frammento di DNA.

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Autore dell'articolo: Admin

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