Nucleasi: enzimi che lavorano sugli acidi nucleici

Le nucleasi sono enzimi capaci di “lavorare” sia sul DNA che sull’RNA, in quanto idrolizzano i legami fosfodiesterei fra due nucleotidi presenti negli acidi nucleici. Nella classificazione EC, che è un sistema di categorizzazione degli enzimi, corrispondono al codice 3.1.21. Sono stati scoperti attorno agli anno 60′, periodo in cui nasceva una nuova branca della biochimica: […]

Legame fosfodiesterico: DNA ed RNA

Il legame fosfodiesterico (o fosfodiestereo) è un tipo di legame covalente in cui un atomo di fosforo è collegato a due molecole attraverso due legami esterei. Questo tipo di legame è fondamentale per la vita, perché si trova all’interno del DNA e dell’RNA. Come sappiamo, il DNA e l’RNA sono dei polimeri di alcune molecole chiamate nucleotidi. Essi sono tenuti insieme proprio da legami […]

Clonaggio nei cosmidi: frammenti da 35-45k basi

Il clonaggio è una tecnica di biologia molecolare molto utilizzata perché permette di amplificare, all’interno di alcuni vettori di clonaggio, dei frammenti di DNA da studiare. Sappiamo che ci sono vari vettori di clonaggio: Plasmidi, di cui abbiamo parlato nei precedenti appunti (PBR e pUC) Fago lambda Cosmidi YAC In questi appunti parleremo del clonaggio nei […]

Clonaggio in fago lambda: frammenti da 15k basi

Il clonaggio è una tecnica di biologia molecolare molto utilizzata perché permette di amplificare, all’interno di alcuni vettori di clonaggio, dei frammenti di DNA da studiare. Sappiamo che ci sono vari vettori di clonaggio: Plasmidi, di cui abbiamo parlato nei precedenti appunti (PBR e pUC) Fago lambda Cosmidi YAC In questi appunti parleremo del clonaggio in […]

Cellule competenti e trasformazione

Il clonaggio fu una tecnina innovativa che ha permesso ai biologi molecolari di studiare particolari regioni di un genoma. I primi vettori di clonaggio furono i plasmidi, all’interno dei quali venivano aggiunti dei pezzi di DNA da amplificare e successivamente studiare. Abbiamo già visto nei precedenti appunti sul clonaggio in PBR e in pUC come […]

Clonaggio in plasmidi pUC

Il clonaggio fu una tecnica innovativa perché permetteva di ottenere miliardi di molecole di DNA, tutte uguali, su cui lavorare per effettuare studi su specifici geni. I primi vettori di clonaggio furono i plasmidi, che vennero purificati da batteri. Cosa sono i plasmidi? I plasmidi sono piccoli filamenti circolari di DNA superavvolto a doppia elica, presenti nel citoplasma e distinguibili dal cromosoma batterico […]

Clonaggio in plasmidi PBR

Il clonaggio fu una tecnica innovativa perché permetteva di ottenere miliardi di molecole di DNA, tutte uguali, su cui lavorare per effettuare studi su specifici geni. I primi vettori di clonaggio furono i plasmidi, che vennero purificati da batteri. Cosa sono i plasmidi? I plasmidi sono piccoli filamenti circolari di DNA superavvolto a doppia elica, presenti nel citoplasma e distinguibili dal cromosoma batterico […]

Lavaggi dei filtri e stripping

Abbiamo parlato nei precedenti appunti dell’ibridazione su supporto e del Southern Blotting, una tecnica che ci permette di trasferire i frammenti di DNA dal gel di agarosio adun filtro di nylon. Una volta effettuato il trasferimento degli acidi nucleici vengono fatti i processi di pre-ibridazione e di ibridazione. A questo punto la sonda avrà ibridato […]

Southern Blotting: metodo idratato e a secco

Il Southern blotting è una tecnica utilizzata per trasferire i frammenti di DNA da un gel di agarosio, dove sono stati separati in base alle loro dimensioni, ad un filtro di nylon. Il filtro poi subirà una serie di processi e infine verrà utilizzato per l’ibridazione. Per trasferire il DNA da gel a filtro possiamo […]

Ibridazione del DNA: costruzione mappe fisiche

Per costruire le mappe fisiche di restrizione di interi genomi i biologi molecolari utilizzano la tecnica dell’ibridazione. Due tipi di ibridazione Ibridazione in soluzione: si denaturano i due filamenti del DNA da ibridare e si mettono ad incubare con filamenti prelevati da un altro organismo tassonomicamente vicino. Tra questi filamenti ci può essere un’elevata similarità […]