Determinare residuo N-terminale: reattivo di Sanger ed Edman

Come già sappiamo per studiare le funzioni di una proteina è fondamentale risalire alla loro struttura primaria, cioè alla sequenza lineare degli amminoacidi. Abbiamo visto nei precedenti appunti i metodi utilizzati per rompere i ponti disolfuro e separare le varie sub-unità che costituiscono le proteine.

Oggi vediamo come trovare il residuo N-terminale, cioè il primo amminoacido di una proteina. Si usano delle molecole che vanno a marcare il primo amminoacido e dopo si fanno degli altri trattamenti. I reagenti utilizzati sono 2:

  • Il reagente di Sanger.
  • Il reagente di Edman.

Metodo di Sanger

La catena polipeptidica da sequenziare viene trattata con il reagente di Sanger, che è il FDNB (fluoro-dinitro-benzene).

Il FDNB si lega con il primo amminoacido formando il derivato 2,4-dinitrofenilico del polipeptide. Successivamente si fa un trattamento con HCl 6M che rompe tutti i legami peptidici portando alla formazione del derivato 2,4 dinitrofenilico del residuo N-terminale più tutti gli amminoacidi liberi.

Struttura del reattivo di Sanger e funzionamento

Con questo metodo possiamo trovare solo il primo aa, perché nel momento in cui si fa l’idrolisi con HCl 6M tutti i legami peptidici vengono rotti e tutti gli altri aa si troveranno liberi in soluzione.

Reazione di Edman

Usando il reattivo di Edman, che è il PITC (fenil-iso-tio-cianato), possiamo sempre marcare l’amminoacido N-terminale.

La differenza rispetto alla reazione di Sanger è il trattamento successivo perché la rottura del legame peptidico viene fatta in condizioni più blande utilizzando l’acido trifluoro acetico (TFA).

L'acido trifluoro acetico è usato nella reazione di Edman
Struttura dell’acido trifluoro acetico

Con il trattamento con il TFA il primo amminoacido, che è quello marcato, si stacca ma il resto della catena rimane integro e quindi è possibile ripetere la stessa reazione sulla catena polipeptidica rimasta. Ripetendo più di una volta questo processo possiamo risalire alla struttura primaria di una proteina.

Struttura del reattivo di Edman e funzionamento

Il metodo di Edman è molto efficente per i primi cicli ma dopo si possono formare dei sottoprodotti e la reazione perde di efficacia.

Proprio per questo motivo la proteina deve essere suddivisa in diversi frammenti utilizzando le proteasi, così facendo abbiamo più pezzi (non troppo grandi) che possono essere sequenziati in maniera efficiente con il reattivo di Edman. In questi appunti parliamo delle proteasi utilizzate per ricavare la sequenza di una proteina.

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