Clonaggio nei cosmidi: frammenti da 35-45k basi

Il clonaggio è una tecnica di biologia molecolare molto utilizzata perché permette di amplificare, all’interno di alcuni vettori di clonaggio, dei frammenti di DNA da studiare. Sappiamo che ci sono vari vettori di clonaggio: Plasmidi, di cui abbiamo parlato nei precedenti appunti (PBR e pUC) Fago lambda Cosmidi YAC In questi appunti parleremo del clonaggio nei […]

Clonaggio in fago lambda: frammenti da 15k basi

Il clonaggio è una tecnica di biologia molecolare molto utilizzata perché permette di amplificare, all’interno di alcuni vettori di clonaggio, dei frammenti di DNA da studiare. Sappiamo che ci sono vari vettori di clonaggio: Plasmidi, di cui abbiamo parlato nei precedenti appunti (PBR e pUC) Fago lambda Cosmidi YAC In questi appunti parleremo del clonaggio in […]

Cellule competenti e trasformazione

Il clonaggio fu una tecnina innovativa che ha permesso ai biologi molecolari di studiare particolari regioni di un genoma. I primi vettori di clonaggio furono i plasmidi, all’interno dei quali venivano aggiunti dei pezzi di DNA da analizzare. Abbiamo già visto nei precedenti appunti sul clonaggio in PBR e in pUC come si arriva alla […]

Clonaggio in plasmadi pUC

Il clonaggio fu una tecnica innovativa perché permetteva di ottenere miliardi di molecole di DNA su cui lavorare. I primi vettori di clonaggio furoni i plasmidi, che vennero purificati da batteri. Cosa sono i plasmidi? I plasmidi sono piccoli filamenti circolari di DNA superavvolto a doppia elica, presenti nel citoplasma e distinguibili dal cromosoma batterico per le loro dimensioni ridotte. Vengono utilizzati come […]

Clonaggio in plasmadi PBR

Il clonaggio fu una tecnica innovativa perché permetteva di ottenere miliardi di molecole di DNA su cui lavorare. I primi vettori di clonaggio furoni i plasmidi, che vennero purificati da batteri. Cosa sono i plasmidi? I plasmidi sono piccoli filamenti circolari di DNA superavvolto a doppia elica, presenti nel citoplasma e distinguibili dal cromosoma batterico per le loro dimensioni ridotte. Vengono utilizzati come […]

Lavaggi dei filtri e stripping

Abbiamo parlato nei precedenti appunti dell’ibridazione su supporto e del Southern Blotting, una tecnica che ci permette di trasferire i frammenti di DNA dal gel di agarosio su un filtro di nylon. Una volta effettuato il trasferimento degli acidi nucleici vengono fatti i processi di pre-ibridazione e di ibridazione. A questo punto la sonda avrà […]

Southern Blotting: metodo idratato e a secco

Il Southern blotting è una tecnica utilizzata per trasferire i frammenti di DNA dal gel, dopo essere stati separati in base alle loro dimensioni, sul filtro di nylon. Il filtro poi subirà una serie di processi e infine verrà utilizzato per l’ibridazione. Per trasferire il DNA da gel a filtro possiamo utilizzare due metodi: uno […]

Ibridazione del DNA: costruzione mappe fisiche

Per costruire le mappe fisiche di interi genomi i biologi molecolari utilizzano la tecnica dell’ibridazione. Due tipi di ibridazione Ibridazione in soluzione: si denaturano i due filamenti del DNA e si mettono ad incubare con filamenti prelevati da un altro organismo tassonomicamente vicino. Tra questi filamenti ci può essere un’elevata similarità e quindi è possibile […]

Marcatura terminale del DNA in 5′ e 3′

Abbiamo già detto, nei precedenti appunti, che per costruire le mappe fisiche di regioni del DNA si utilizzano gli enzimi di restrizione in digestioni parziali o totali. Quando dobbiamo costruire le mappe fisiche di restrizione di molecole più complesse un altro approccio è quello di marcare le estremità delle molecole con delle sostanze radioattive. Dopo […]

Tagli parziali per mappe fisiche di restrizione

Per costruire le mappe fisiche di restrizione di molecole di DNA più lunghe e più complesse è molto utile fare dei tagli parziali sulle molecole. I tagli parziali si effettuano in condizioni limitanti di enzima o in condizioni limitanti di digestione. Nel primo caso, nella provetta, aggiungiamo una piccola quantità di enzima, mentre nel secondo […]